YUKARI
 ANA SAYFA > CHALLENGE TEST HAKKINDA
TEST METODU

KOZMETİK ÜRÜNLERDE ANTİMİKROBİYAL KORUYUCU ETKİNLİK (CHALLENGE-TARAMA ZORLAMA) TEST METODU
 
Kozmetik ürünlerde antimikrobiyal koruyucu etkinlik test en az iki aşamada yapılmalıdır.

1-Kozmetik üründe koruyucu madde sisteminin geliştirilmesi sırasında
2-Kozmetik ürünün içeriğindeki bileşenler ile formülasyon uyumluluk testinden ya da stabilite testinden sonra ( bitmiş kozmetik ürün de ya da kullanımda, koruma etkinliği değerlendirmesi olarak)

Antimikrobiyal Koruyucu Etkinlik (Challenge/Tarama Zorlama) testi, bitmiş kozmetik ürün formülünün yapay kontaminasyona maruz bırakılarak mikrobiyal kontaminasyon riskinin değerlendirilmesine dayanır. Kullanılan tüm yöntemlerde esas, test örneğinin farklı mikroorganizmalar ile bir araya getirilmesinden sonra, farklı zamanlarda alınan test örneklerinde canlı kalan mikroorganizma sayısının belirlenmesidir. Uygulanan yöntemler, deney mikroorganizmaları, kullanılan besiyerleri, örneklerin saklanma koşulları ve testin uygulanışı açısından farklılık göstermektedir. Testlerin tekrarlanabilirliğinin sağlanması için kullanılacak mikroorganizmalar ülkelerin resmi koleksiyonlarından alınmış suşlardan olmak üzere;
  • Pseudomonas aeruginosa ( ATCC 9027)
  • Staphylococcus aureus (ATCC6538)
  • Candida albicans (ATCC 10231)
  • Escherichia coli  (ATCC 8739 )
  • Aspergillus brasiliensis  (ATCC 16404 )
PRENSİP: Test, öngörülen uygun bir mikroorganizma aşı ile kirlenmemiş bir ürüne meydan okumayı ve aşılanmış ürünü öngörülen bir sıcaklıkta depolamayı içermektedir. Seri seyreltme ve plaka sayımı kullanarak, test ürünlerinde kalan organizmaların sayısı belirli aralıklarla belirlenir. Belirtilen kriterleri karşılayan ürünler, imalat ve tüketicilerin kullanımı için yeterince korunmuş sayılır. Kriterleri karşılamayan ürünler yeterince korunmamış sayılır.
 
  • Ürün Ar-Ge aşamasında iken koruyucu ile formülasyonun uyumluluğu, bitmiş üründe eklenen koruyucunun etkinliğinin belirlenmesi durumlarında Challenge test uygulanmalıdır. Önemli not: Eğer mevcut üründe formülasyon değişikliğine gidildiyse o ürün için yeni bir Challenge test uygulanmalıdır.
  • Öncelikle testin başlangıcında her bir kozmetik ürünün temizliği, mikrobiyal florası kontrol edilmelidir. Kullanılan ISO 11930 Standardına göre, koruyucu etkinlik testine başlamadan önce gelen numunenin toplam aerobik mezofilik canlı (ISO 21149) ve küf-maya (ISO 16212) sayımının yapılması gerekmektedir. Bu testler sonuçlandıktan sonra koruyucu etkinlik testine başlanır.
Antimikrobiyal Koruyucu Etkinlik (Challenge/Tarama Zorlama) Test Mikroorganizmalarının Hazırlanması
Testte kullanılan canlı mikroorganizmalar, orijinal ATCC (veya eşdeğeri) kültürden olmalıdır. Challenge test analizinde her zaman A. brasiliensis için 5-7 gün’lük C. albicans ve bakteriler için 24 saatlik aktif mikroorganizmalar kullanılmalıdır.

Stok kültürler canlandırılır inkübasyon sonunda her organizma kendi besiyerine aktarılır.

Mc Farland Hazırlanması
McFarland baryum sülfat bulanıklık standardı sıvı ortamda oluşturulan bakteri süspansiyonlarında bulanıklık ile oluşturulan McFarland standartlarının gözle karşılaştırılarak içerdikleri bakteri sayısını yaklaşık olarak saptamayı sağlamaktadır. McFarland standartları, baryum klorit ve sülfürik asitin karışımı suçu oluşan baryum sülfatın neden olduğu bulanıklık esasına dayanır. Baryum klorit ve sülfürik asidin farklı volümlerde karıştırılması ile oluşan farklı bulanıklık düzeyleri ile bakterilerin farklı sayıları ile oluşturduğu bulanıklıkların karşılaştırılarak standardize edilmesi sağlanır. McFarland 0.5; süspansiyon içinde 1,5X108 cfu/mL (genellikle 1,0X108 ile 2,0X108 arasında cfu/mL) bakteri varlığını ifade etmektedir.
Hazırlanan Mc Farland çözeltisi referans alınarak, steril edilmiş MRD(Maximum Recovery Diluent)  içerisine petrilerde oluşan mikroorganizma kolonilerinden bir miktar alınır, elle homojen olana kadar karıştırılır, koyu renk bir zemin üzerinde bulanıklıklar karşılaştırılır. İstenilen Mc Farland referans bulanıklığı yakalanana kadar işlem devam eder. Bu işlemler Candida albicans ve her bir bakteri suşu için ayrı ayrı yapılır.
Her organizma Mc Farland bulanıklığına göre ayarlandıktan sonra numuneler hazırlanır.



Genellikle deneylerde kullanılan bakteri konsantrasyonları 1x108 koloni oluşturan birim/mL (kob/mL), ürün içerisinde ulaşılan konsantrasyon miktarı ise 1x106 kob/mL’dir.
Küf veya maya konsantrasyonu kullanılan etkinlik testine göre 1x1041x106 kob/mL arasında değişmektedir. Tüm test metotlarında ürün içine eklenen mikroorganizma miktarının % 1’i geçmemesi gerekmektedir.




Uygulanan test yöntemine göre değişmekle birlikte, ISO 11930 a göre 0, 7, 14 ve 28. günlerde mikroorganizma sayımları için ürün, içindeki koruyucu maddenin etkinliğini ortadan kaldırmak amacıyla nötralizana alınmakta, nötralize edilen bu örneklerden, uygun seyreltmeler yapılarak, sayım uygulanmaktadır.

Test sonucu, her test yönteminin değerlendirme kriterleri doğrultusunda belirlenmektedir. 

Mikrobiyal kontrol ve challenge testin deney performansı bir mikrobyolog tarafından doğrulanmalıdır.





• USP ve CTFA’nın belirlediği test değerlendirme kriterlerine göre; 14. günde belirlenen bakteri sayılarının başlangıç sayısına göre en az 2-log azalması, 28. günde 14. gündeki sayıya göre artış olmaması; mantar sayısının ise 14. ve 28. günlerde başlangıç sayısına göre artış göstermemesi gerekmektedir. 
• EP ve BP’ne göre ise; bakteri sayılarının 2. gün 2-log, 7. gün 3-log azalmış olması ve 28. günde yapılan sayımlarda artmaması; mantar sayılarının ise 14. günde 2-log azalması ve 28. günde artmaması gerekmektedir. 
• ASTM’nin belirlediği değerlendirmede ise; bakteri ve maya başlangıç sayılarının her yedi günlük test periyotlarında en az % 99.9 azalma göstermesi, 28. günde belirlenen mantar sayılarının en az % 90 azalmış olması ve test periyodu boyunca artmaması kriter olarak kabul edilmektedir.